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    含锶及PRF的复合材料的制备、表征及体外生物活性评价

    来源: www.workforlgbt.org 作者:lgg 发布时间:2015-08-28 23:23 论文字数:36958字
    论文编号: sb2015082012355714332 论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:硕士毕业论文 论文价格: 150
    本文是临床医学论文,nHA/PLGA 复合支架材料因其优秀的生物相容性及生物降解性应用广泛,但其表面缺少活性基团,因此多与其它活性成分共同复合形成复合材料应用于骨组织工程中。

    第 1 章 研究背景


    1.1 锶在骨代谢中的研究进展
    锶是人体必需的微量元素之一,原子序数 38,与镁、钙等同族。人体中所含的锶元素为碱土金属元素,属非放射性锶,它的化学结构和极性与钙元素相似,在体内以二价阳离子的形式存在,并在体内发挥着诸如调节内分泌、调节肌肉兴奋收缩耦联及骨的发育等与钙类似但较钙略弱的生理作用。1808 年, 由Humphry Davy(英国,伦敦)首次分离出。正常人体中大约含有 320mg 的锶,几乎人体内所有组织中都含有锶,锶具有亲骨性,人体中约 99%的锶都存在于骨骼和牙齿中。20 世纪 50 年代有学者提出锶在骨稳态中有积极作用[1],后期研究表明锶对骨改建有双重影响——促进骨形成和抑制骨吸收[2-8]。锶具有防龋、增强骨骼强度、防止骨质疏松的作用。锶在骨基质中保持恒定的比例可以维持骨质的正常功能。间充质干细胞(MSC)是具有多分化潜能的的干细胞,可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[9]。经学者研究表明间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞和成骨细胞的分化分别受关键转录因子 PPARγ2 和 RUNX2 调控[10,11]。体外对鼠骨髓间充质干细胞的研究证实锶可以调控间充质干细胞的谱系分化,锶通过 Wnt 和NFATc/Maf 信号减少了脂肪形成相关因子 PPARγ2、CEBPα 和 LPL 的表达,并上调间充质干细胞分化阶段向成骨细胞分化的主要调控基因--Runx2 基因的表达,同时增强了基质的矿化[12,13,14]。体内研究中,在正常鼠和卵巢切除鼠模型(模拟骨质疏松动物模型)中,锶的应用减少了 MSC 向脂肪分化的基因表达并增强了其向成骨细胞分化的表达[14,15]。同时,环氧合酶-2(COX-2)诱导的雷纳酸锶产生前列腺素 E2(PGE2)在雷纳酸锶诱导骨髓基质细胞的成骨向细胞分化作用中也扮演了重要的角色[16]。因此,我们得出结论,锶可以通过多种信号通路促进间充质干细胞(MSC)向成骨细胞分化。
    ……..


    1.2 富血小板纤维蛋白(PRF)在骨代谢中的研究进展
    血小板浓缩物最早是作为成分输血被应用于治疗和预防因髓质发育不全导致的血小板减少性贫血、白血病以及多种原因引起的严重出血中。这种用于成分输血的血小板浓缩物的命名为富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma,PRP),原则上,每单位 PRP 内应该含有不低于 5×1011个血小板。随着进一步的探索,有研究者发现血小板浓缩物还有加速组织的愈合方面的能力,其临床应用最早出现于口腔颌面外科领域[59]。约半个世纪前,有学者开始研究血液衍生制品在创伤修复方面的作用,并且开始将其应用于临床。最早被应用于临床修复创伤的血液衍生制品为纤维蛋白胶,临床上用来封闭创口并且促进创伤处的组织修复[60]。目前,这种来源于人体的纤维蛋白胶已经被广泛应用于修复组织创伤并且形成商品化的生物制品。但是这些生物制品的实质为同种异体血液衍生物,无法避免存在个体间交叉污染的风险,这也是其临床应用一直备受质疑的主要原因之一。因此,自体的纤维蛋白胶是最理想的血液衍生物制品,但是自体纤维蛋白胶的制备方法的复杂性和昂贵的消耗,阻碍了其临床应用[61]。后期,有学者提出自体血小板浓缩物可替代纤维蛋白胶来促进组织修复[62]。目前也出现了若干种制备这种自体血小板浓缩物的商品化的试剂盒,这些商品化的试剂盒得到的产物即 PRP,实质上该类产品的最主要的成分都是纤维蛋白和血小板。血小板内部含有大量的促生长因子,可以不同程度的促进细胞的增殖,基质的改建以及血管化,这些生长因子主要包括转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子-AB(PDGF-AB)、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)和血管内皮生长因子(VEGF)等。虽然目前 PRP 商品化试剂盒的种类繁多,但是其实质上都是采集患者的静脉血后加入抗凝剂,随后通过不同速度、时间和次数来使血液分层,去掉最上层的澄清的贫血小板血浆(Platelet-Poor Plasma,PPP),弃掉最底层的红细胞碎片,保留中间的血小板和白细胞混合的混合层,也有不同的制法将这层的白细胞弃掉,最后将该层血液与凝血酶和氯化钙混合形成凝胶,应用于临床。生
    ……….


    第 2 章 不同浓度锶对 MG63 增殖及分化的影响


    人成骨肉瘤 MG63 细胞株是一个非常常用的细胞模型,因其具有成骨细胞表型特征,所以经常被用来研究成骨细胞对某些影响因素的反应[114]。成骨细胞在骨缺损后的骨重建过程中起着至关重要的作用。锶目前已经被证实其对骨改建有双重影响——促进骨形成和抑制骨吸收,然而国内外文献对其在影响骨代谢方面发挥有效作用的最佳浓度说法不一。本研究采用体外实验研究不同浓度锶对MG63 增殖及分化的影响,拟找出锶对 MG63 细胞促增殖分化的最佳浓度。


    2.1 材料及方法


    2.1.1 主要实验材料与仪器设备
    细胞培养瓶、板 Costar 美国SrCl2Sigma 美国
    高糖 DMEM(H-DMEM) Gibco 美国
    胎牛血清 Gibco 美国0.25%胰蛋白酶 北京
    鼎国 中国二甲基亚砜(DMSO) 北京鼎国 中国
    青链霉素 华北制药 中国CCK-8 试剂盒 SAB 中国
    碱性磷酸酶试剂盒 南京建成 中国
    磷酸盐缓冲溶液(PBS) 自配(0.1 M pH = 7.4)
    超净工作台 苏州净化 中国
    CO2恒温培养箱 Heraeus 德国
    水浴锅 Shellab 美国


    2.2 实验结果
    不同浓度的锶对 MG63 细胞的增殖的影响如图 2.1 所示。CCK-8 结果显示细胞培养第 1 天,50 g/ml 组、500 g/ml 组和 1000 g/ml 组的 OD 值均较空白组高,并且与空白组对比有显著性差异,但三组间对比没有显著性差异。细胞培养第 3天,50 g/ml 组和 500 g/ml 组 OD 值较高,且这两组均与 10 g/ml 组和空白组有显著性差异,与 1000 g/ml 组无显著性差异,但两组间无显著性差异。细胞培养第 5 天,500 g/ml 组 OD 值明显高于各组,且与各组均有显著性差异,其余各组间无显著性差异。不同浓度的锶对 MG63 细胞的成骨分化能力的影响如图 2.2 所示。ALP 测定结果显示细胞培养第 1 天,50 g/ml 组、500 g/ml 组和 1000 g/ml 组的 OD 值均较空白组高,并且与空白组对比有显著性差异,但与 10 g/ml 组无明显差异,且三组间对比没有显著性差异。细胞培养第 3 天,50 g/ml 组、500 g/ml 组和1000 g/ml 组 OD 值较高,且这三组均与 10 g/ml 组和空白组有显著性差异,但三组组间无显著性差异。细胞培养第 5 天,500 g/ml 组 OD 值明显高于各组,且与各组均有显著性差异,显示出强烈的促细胞成骨分化的特性,其余各组间无显著性差异。
    ……….


    第 3 章 冻干 PRF 的制备及生长因子提取的相关研究......23
    3.1 材料及方法 ......... 23
    3.2 实验结果 ...... 25
    3.2.1 新鲜 PRF 及冻干 PRF 中生长因子的释放.... 25
    3.2.2 新鲜 PRF 及冻干 PRF 在扫描电镜下的结构 ....... 27
    3.3 讨论 ....... 27
    3.5 小 结 ..... 29
    第 4 章 复合材料的制备、表征及降解性研究.....31
    4.1 材料及方法 ......... 31
    4.2 实验结果 ...... 34
    4.3 讨论 ....... 39
    4.4 小结 ....... 41
    第 5 章 载药复合材料对 MG63 黏附,增殖以及分化的影响.........43
    5.1 材料及方法 ......... 43
    5.2 实验结果 ...... 46
    5.3 讨论 ....... 49
    5.4 小结 ....... 51


    第6章 载药复合材料对MG63成骨相关功能基因及蛋白的影响


    如前面研究所述,我们制备的复合成骨材料具有良好的理化性能,生物安全性可靠,而且可以对 MG63 细胞在体外起到促进黏附、增殖及分化的作用。本章节将从分子水平探讨载药复合材料对 MG63 细胞成骨相关功能基因及蛋白表达的影响。将 nHA/PLGA/Gel/Sr/PRF 设为实验组一,nHA/PLGA/Gel/Sr 设为实验组二,nHA/PLGA/Gel 设为空白支架组,在细胞培养基中高速离心,使其浸没在培养基内,将材料取出放入 6 孔板内。将对数增长期的 MG63 细胞消化后计数,每个孔内接种 2×105个细胞后放置于 5%CO2,37℃恒温孵箱中培养分别于第 1、3、5天终止培养。检测成骨相关标志基因 CollagenⅠ 1,Runx2,SP7,OPN 的表达情况。取1 l RNA样品,使用 Nanodrop 超微量核酸蛋白分析仪检测 260nm/280nm和 260nm/230nm 的比值,衡量 RNA 纯度,要求 260nm/280nm 在 1.8 以上,260nm/230nm 在 2 以上。测定 RNA 浓度,使在逆转录时,各个样本的 RNA含量相等。

    ……..


    结 论


    1. 500 g/ml 的浓度的 SrCl2对 MG63 细胞的促增殖能力及促分化能力最强。
    2. 冻干 PRF 较新鲜 PRF 疏松且有较大的孔洞,冻干 PRF 内部的的纤维条索较细。冻干 PRF 粉末具有强烈的突释生长因子的特性,为生长因子的提取提供便利。
    3. 开环聚合法制备的水凝胶相变温度符合生物材料的体内应用要求。粒子沥滤法合成的支架材料内部结构符合生物支架材料的要求。首次成功将水凝胶注入疏松支架材料内部,形成新型复合支架材料。首次成功将水凝胶作为装载缓释系统将 PRF 衍生生长因子及锶载入支架材料中。
    4. 复合支架材料的缓释效果明显,复合支架材料的体外降解实验及机械性能测试证实其完全符合骨支架材料的要求。
    5. 载药复合支架材料对成骨细胞的黏附、增殖以及分化有一定的促进作用,且复合支架材料生物安全性可靠,无明显毒性作用。
    6. 载药复合支架材料对成骨相关基因及蛋白有明显的促表达作用。且空白支架材料对成骨相关基因蛋白也有少量的促进作用。
    ............
    参考文献(略)


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