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    加味白头翁散益生菌发酵产物的制备及其对肉仔鸡大肠杆菌病的医学防治分析

    来源: www.workforlgbt.org 发布时间:2020-03-11 论文字数:62366字
    论文编号: sb2020030222452929720 论文语言:中文 论文类型:博士毕业论文
    本文是一篇医学论文,笔者认为.中药发酵的益生菌为枯草芽孢杆菌;该菌株对加味白头翁散进行发酵,可改变部分中药成分及含量,产生了新的物质。发酵产物对仔鸡致病性大肠杆菌感染有较
    本文是一篇医学论文,笔者认为.中药发酵的益生菌为枯草芽孢杆菌;该菌株对加味白头翁散进行发酵,可改变部分中药成分及含量,产生了新的物质。发酵产物对仔鸡致病性大肠杆菌感染有较好的防治作用;加味白头翁散发酵产物可提高肉仔鸡淋巴器官指数,淋巴细胞转化能力、红细胞补体结合率,血清细胞因子含量;提高肉仔鸡多种抗氧化指标,降低丙二醛含量。

    第 1 章 中药防治鸡大肠杆菌病研究进展

    1.1 鸡致病性大肠杆菌的耐药现状
    1.1.1 鸡致病性大肠杆菌耐药性分析
    鸡的致病性大肠杆菌耐药性菌株不断产生主要与抗生素的滥用有直接关系,临床上分离的大部分致病性大肠杆菌对常用的抗菌药物均产生了不同程度的耐药性,而且在不同地区、同一地区不同时期分离的大肠杆菌菌株耐药种类和耐药程度都有很大的差异[11-14]。随着抗菌药物种类的不断增加以及抗菌药物的滥用,禽源大肠杆菌的耐药谱也迅速扩大,交叉耐药、多重耐药现象越来越严重。
    朱恒乾[15]等对广东地区禽源大肠杆菌的耐药性进行研究,结果表明耐药率逐年上升,主要集中在 5-12 种抗生素多重耐药。郝智慧[16]等对山东省、河北省和辽宁省等不同区域肉鸡病料中的 264 株大肠杆菌的 29 种抗菌药的耐药性进行检测,结果表明山东省的鸡大肠杆菌耐抗菌药物的种类为 29 种、辽宁省的鸡大肠杆菌耐抗菌药物的种类 23 种。山东省、河北省和辽宁省三地的致病性大肠杆菌菌株对磺胺-6-甲氧嘧啶、氨苄西林钠、土霉素、阿莫西林、酒石酸泰乐菌素 5种抗菌药物的耐药率均在 90.0 %以上;山东与河北的分离株对甲砜霉素 、山东及辽宁分离株对硫酸链霉素和盐酸金霉素、河北及辽宁分离株对恩诺沙星和磷霉素钠、辽宁分离株对甲磺酸达氟沙星、延胡索酸泰妙菌素的耐药率均在 80.0 %以上。宋立[17]等从中国的华南、华中、华北及东北四地区共分离到 240 多株大肠杆菌,其耐药性状况非常的严重,并且以多重耐药为主,某些地区内 50%以上的菌株甚至耐 10~19 种药物。其中,对萘啶酸、四环素、磺胺甲基异恶唑等耐药率高达 88.1%、85.7%、81.0%。对复方新诺明、氨苄西林以及阿莫西林等抗菌药物的耐药率也均在 70%以上;对链霉素、氟喹诺酮类以及氯霉素等耐药率分别是66.2%、57.1%~66.7%、52.9%;而对氟苯尼考、阿米卡星、奥格门丁等新的抗菌药物也已经出现了一定程度的耐药。冯敏燕[18]等对山东省鸡大肠杆菌耐药变化趋势研究结果表明,2008-2014 年分离鉴定的 210 株鸡源大肠杆菌对头孢噻呋、大观霉素、多西环素、硫酸粘菌素、庆大霉素、环丙沙星、新霉素、氟苯尼考、恩诺沙星等 14 种抗生素的耐药性达 13 种,其中对 10 种抗生素的耐药性翻了一翻。赵素华[19]等对 31 株致病性大肠杆菌耐药性分析,结果表明对复方磺胺甲基异噁唑、阿莫西林、氟苯尼考等 11 种抗菌药物均出现了不同程度的多重耐药性;这些菌株对磺胺二甲嘧啶、复方磺胺甲基异噁唑、恩诺沙星耐药比例在 70%以上;对庆大霉素、阿莫西林、氟苯尼考、链霉素、卡那霉素、环丙沙星耐药比例在16%以上;对头孢唑肟、头孢噻肟、阿米卡星等新型抗菌药物也出现接近 10%的耐药性。毛福超[20]等从豫西地区分离鉴定的 98 株鸡源大肠杆菌对 20 种抗生素的耐药性分析表明,对复方新诺明的耐药率高达 95.92%,对四环素的耐药率为83.67%、对氨苄西林的耐药率为 81.63%,对萘啶酸的耐药率为 77.55%、对恩诺沙星的耐药率为 69.39%。大多为多重耐药性,其中有 2 株耐药药物的种类多达18 种抗生素,有 76 株致病性大肠杆菌对 9-14 种抗生素存在多重耐药。
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    1.2 鸡致病性大肠杆菌耐药的生化机制
    在抗菌药物的选择性筛选压力下,致病性大肠杆菌的耐药性从单一耐药到多重耐药,再到超级耐药,耐药机制不断的除旧布新,耐药性基因通过突变获得,还可通过转座子、R 质粒以转化、转导、接合等水平方式在不同菌株之间进行传递,大大地提升了大肠杆菌病的防治难度。
    1.2.1 产酶耐药
    大肠杆菌耐药菌株能产生分解酶或钝化酶,使抗菌药物活性降低或完全失活。大肠杆菌能产生近 40 种的β-内酰胺酶[22],而β-内酰胺酶能破坏内酰胺环的靶位结构基团,使β-内酰胺类药物失去活性从而产生耐药性;大肠杆菌能产生氨基糖苷类修饰酶(例如乙酰转移酶、核苷转移酶和磷酸转移酶),此酶作用于氨基糖苷类的抗生素后,可使抗生素游离的氨基被乙酰化、磷酸化、核苷化,结果就使抗菌药物不能与作用的靶位结合,从而失去了抑菌活性;喹诺酮类药物耐药机制是氨基被氨基糖苷乙酰转移酶乙酰化而产生耐药[23,24];在氯霉素乙酰转移酶作用下,氯霉素转变为 3-乙酰氯霉素,就失去了与细菌的核糖体结合的能力,进而就丧失了其抗菌活性[25]。大肠杆菌可产生大环内酯磷酸转移酶,可使大环内酯类的抗菌药物的内酯环被破坏从而产生了耐药性[26]。
    1.2.2 靶位结构改变
    抗菌药物通过与细菌表面不同部位的靶位蛋白相结合,抑制靶位蛋白的功能发挥杀菌、抑菌作用。大肠杆菌通过修饰靶位蛋白结构、或大肠杆菌自身发生遗传变异而改变抗生素靶位蛋白结构,使靶位蛋白结构与抗生素结合力下降、甚至不能结合而出现不同程度的耐药。
    青霉素靶位蛋白主要的生物学功能是参与细菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成、维持细菌细胞的外形,也能维持和调整糖肽结构。青霉素的靶位蛋白是β-内酰胺类的抗菌药物特异性结合的靶位蛋白,抗菌药物与靶位蛋白结合后就发挥抑制细菌细胞壁的形成而发挥其杀菌作用。当青霉素靶位蛋白的数量增加、减少或缺失,靶位蛋白与抗菌药物的结合能力降低以及误导性靶位蛋白的产生都会使大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素表现出耐药性。大肠杆菌核糖体 50s 亚基的改变使大肠杆菌对氟苯尼考和氯霉素耐药[27]。而大肠杆菌核糖体 30s 亚基中 S12 靶位蛋白的改变就使大肠杆菌对氨基糖苷类抗菌药物产生了耐药性[28]。
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    第 2 章 中药发酵研究进展

    2.1 中草药发酵机理及优势
    中草药的发酵是微生物在适宜的条件下、在新陈代谢的过程中产生纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等多种胞外酶系,可将植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶等成分降解,促进生物活性成分的释放,催化其他物质进行酯化、氧化、甲基化和还原等生物化学反应。而且中草药中一般都会含有氨基酸、矿物元素、有机酸类、脂类、生物酶类等人和动物生长发育所需要的多种营养元素和生物活性物质[58],常温、常压等温和的发酵可减少传统中草药炮制工艺煮、煎、蒸、熬、炼、浸等对营养元素、维生素、芳香类挥发油等生物活性成分的破坏,最大限度的提取了中草药生物活性成分或转化原有的成分,还可通过生物转化分解毒性物质。同时,益生菌等微生物与中草药具有协同增效的作用,可促进中草药有效成分的吸收,也提高机体的抗病能力。
    2.1.1 降解中草药传质屏障,提高有效组分的含量
    植物中草药的生物活性物质在细胞内,往往被致密的坚韧的细胞壁所包裹,而细胞壁主要是由纤维素等成分构成,生物活性物质要从中草药的胞浆扩散到提取介质中,就必须冲破植物细胞壁及细胞间质的双重阻力。除此以外,中草药的细胞中还含有果胶、蛋白质等复杂成分。利用微生物发酵过程中产生的纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等几十种胞外酶,酶反应能使中草药的细胞壁结构发生降解,有效去除果胶、蛋白等化学成分,促使中草药中的具生物活性的有效成份向提取介质中扩散,从而提高生物活性物质的溶出率。
    图 1.3 CCTCC M 2011286 16S r DNA PCR 扩增结果
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    2.2 益生菌发酵中草药研究进展
    益生菌是微生物在与动物机体长期进化过程中形成的对宿主有益的活性微生物,定植于人及动物的消化系统、生殖系统等与外界相通的体腔中,能产生健康的功效,从而改善宿主的微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌进入动物消化道后,发挥着重要的生物学功能[80,81]:合成氨基酸、维生素等营养物质;产生次生的代谢产物,促进生物转化;产生抑菌物质,直接拮抗病原菌;与病原菌进行占位竞争,增强屏障功能;产生有益物质,降低炎症反应;刺激机体免疫系统的完善,从而通过生物拮抗、营养、免疫、抗衰老及抗肿瘤等作用达到防治消化道疾病和促进生长的双重作用。
    目前,临床上被大众广泛应用的益生菌主要包括三大类[82]:一是双歧杆菌类(例如长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等);二是乳杆菌类(例如干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、詹氏乳杆菌等);三是革兰氏阳性球菌(例如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等)。此外,还包括酪酸梭菌、酵母菌、芽孢杆菌等。而利用微生态调节剂或生态制剂,具有直接补充或促进宿主有益微生物生长的作用,能够维持或调整微生态平衡,从而能达到防病治病、增强宿主抵抗力的作用。
    2.2.1 中草药对益生菌的促生长作用
    大量的研究表明,许多中草药[83,84]发挥着益生元作用,对肠道的益生菌具有促生长的作用,特别是如黄芪、甘草等的益气类中草药。中草药中除含有大量的具有药理作用的活性成分外,还含有蛋白质、维生素和微量元素等多种营养成分,促进益生菌的生长与繁殖,增加肠道益生菌如双歧杆菌、乳酸菌等的种类和数量,对维持动物机体的微生态动态平衡发挥着十分关键作用。中草药的益生元作用机理明显优于寡糖、果胶等益生元,中草药的营养成分促进肠道有益菌的快速增殖,生物活性物质抑制有害菌的生长和增殖,甚至还能抑制或杀灭有害菌,为益生菌的大量增殖扫清障碍,进一步促进肠道益生菌的生长,具有药理和益生元的双重作用。与此不同的寡糖、果胶等益生元对肠道菌的促生长作用不具有特异性,对有益菌和有害菌均促进作用。
    图 1.5 CCTCC M 2011286 系统发育树构建
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    第 3 章 加味白头翁散发酵产物防治肉仔鸡大肠杆菌病对肉仔鸡免疫功能的影响....................35
    3.1 材料与方法................................... 36
    3.1.1 材料.................................36
    3.1.2 方法..................................36
    第 4 章 加味白头翁散发酵产物对大肠杆菌感染肉仔鸡肠道菌群的调节作用...................71
    4.1 材料与方法...................................... 71
    4.1.1 材料................................71
    4.2 方法..................................... 72
    第 5 章 加味白头翁散发酵产物在肉仔鸡无抗养殖中的应用..............................83
    5.1 材料与方法.............................. 83
    5.1.1 材料....................................83
    5.1.2 方法..................................83

    第 5 章 加味白头翁散发酵产物在肉仔鸡无抗养殖中的应用

    5.1 讨论
    加味白头翁散发酵产物组改善 ROSS 308 肉鸡生产性能效果最为明显,其 0-1周龄、1-2 周龄、2-3 周龄、3-4 周龄、4-5 周龄、0-5 周龄的周增重分别比正常对照提高 10.55%、7.32%、16.51%、12.57%、9.8%和 13.89%,日增重分别提高 10.49%、7.32%、16.49%、12.57%、9.78%和 11.49%,料肉比分别下降 2.1%、3.45%、5.6%、9.09%、7.98%和 6.25%, 死淘率分别下降 10.87%、16.58%、17.23%、25.24%、26.14%和 21.60%。
    发酵中药是指中药材或其提取液经一种或多种益生微生物发酵后获得的中药制剂。通过益生菌发酵的中药材或其提取液,不但可增加中药的有效成分,而且还含有益生菌及益生菌多种次级代谢产物等。在益生菌、益生菌次级代谢产物和中药的有效成分共同作用下,肠道微生态菌群能迅速调整至微生态平衡状态,动物机体对中药有效成分和营养物质的吸收利用率得以提高,动物机体的生产性能和免疫力增强,死淘率降低。
    韩春杨[94]等比较了黄芪、党参、茯苓、山楂、麦芽和白术等中草药复方制剂发酵前后成分的变化,发现发酵过程中药成分发生了较大的变化:有些成分的含量升高了 10-30%,出现一些新的特征性吸收峰,还有吸收峰消失的情况。同时,将该中药发酵制剂饲喂肉鸡后,发现肉鸡免疫功能和生产性能均高于未发酵制剂组。刘观忠[95]等研究发现黄芪、贯众、板蓝根、何首乌、山楂、女贞子、艾叶等中草药发酵产物可促进仔鸡的生产性能、提高饲料转化率。谢全喜[92]等发现 1%李糖乳杆菌发酵中草药复合枯草芽孢杆菌能增强白羽肉仔鸡抗病能力,抵抗大肠杆菌感染,显著降低死淘率。史洪涛[173]研究发现黄芪-枯草芽孢杆菌发酵制剂能够显著提高 AA 肉鸡的生产性能和免疫功能,而且效果优于抗生素对照组,可以完全替代抗生素。张凯[174]等将黄芪提取物发酵后饲喂肉仔鸡发现,发酵型黄芪提取物可明显促进肉仔鸡的生产性能以及健康状况。唐燕红[175]研究结果表明,微生物发酵中药能显著提高肉仔鸡的日增重和日采食量,料肉比有下降的趋势,肉仔鸡的生产性能提高;肉仔鸡免疫功能和抗病力增强,作用效果要优于抗生素,可替代抗生素应用于肉仔鸡养殖。戴燊[176]将混菌发酵中草药替代抗生素饲喂肉仔鸡,结果表明混菌发酵中草药可显著提高日增重、日采食量,料肉比差异不显著,混菌发酵中草药可增强肉仔鸡的抗病能力。
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    结论
    1.中药发酵的益生菌为枯草芽孢杆菌;该菌株对加味白头翁散进行发酵,可改变部分中药成分及含量,产生了新的物质。发酵产物对仔鸡致病性大肠杆菌感染有较好的防治作用。
    2.加味白头翁散发酵产物可提高肉仔鸡淋巴器官指数,淋巴细胞转化能力、红细胞补体结合率,血清细胞因子含量;提高肉仔鸡多种抗氧化指标,降低丙二醛含量。
    3.加味白头翁散发酵产物促进肉仔鸡盲肠菌群微生物种类增加、提高菌群多样性;显著提高 ROSS 308 肉鸡生产性能、显著降低死淘率。具有较好的推广应用潜力。
    参考文献(略)

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